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重組DNA的構建(載體構建)

日期:2021-07-29瀏覽:8106次

基本原理:
    外源目的DNA與載體分子的連接稱為DNA重組,重組的DNA稱為重組體或重組子。研究中需要克隆或表達的基因為外源DNA,載體是指能夠攜帶外源基因進入受體細胞,并在其中進行擴增或誘導外源基因表達的工具,其中質粒載體最為常用。
    質粒是獨立于細菌染色體外具有自我復制的DNA分子。所有的質粒都有復制子、選擇性標志和多克隆位點3個共同的特性。質粒載體的選擇包括載體的大小、載體拷貝數、多接頭以及篩選插入片段的能力,pcDNA3.1(+/-)是比較常用的真核表達載體。

基本步驟:
    1、目的DNA片段的獲得。這一步驟中,可以選擇通過設計引物進行PCR擴增來獲得目的DNA片段,也可以通過化學合成的方法來獲得目的DNA片段,這里值得注意的點,目的DNA片段5'和3'端需要引物合適的酶切位點,方便后續與質粒載體的連接。
    2、目的DNA片段與質粒連接。通過選擇的酶切位點將環形的質粒酶切成線性,與目的DNA片段進行連接反應,而后轉化至大腸桿菌感受態細胞中,進行培養。
    3、連接產物轉化及鑒定。挑選2-3個單克隆置于含有抗性的液體
培養基中進行擴大培養。提取質粒進行雙酶切鑒定,雙酶切后電泳,能夠看到存在與目的DNA片段大小一致的條帶,說明此單克隆插入了目的DNA片段,而至于目的DNA片段中堿基序列是否存在突變點,需進行一代測序驗證。只有同時滿足雙酶切鑒定大小合適并且測序后DNA堿基序列*一致的單克隆菌才被認定為構建成功的重組子。
    4、鑒定正確的重組質粒擴大培養及保種。將上述構建成功的重組子質粒菌種再一次擴大培養,提取重組子質粒以及進行保種,方便后續實驗使用。
    值此,包含此外源DNA的重組DNA的構建算全部完成。

注意事項及心得體會:
    1、目的DNA片段獲取過程中,如果選擇通過設計引物進行PCR擴增方法來獲得,建議選擇高保真的酶來進行擴增反應,這樣在一定程度上可以降低因為擴增反應而產生的堿基引入錯誤。
    2、PCR產物和酶切產物盡量不要放置時間過長,最好是即時進行連接。
    3、連接體系中載體與目的基因的分子數比例,需要摸索合適的比例,一般為1:3--1:10,合適的比例能夠提高連接效率。
  

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